Жигулевский заповедник расположен в Среднем Поволжье между 53° 20′ 00″ и 53°27’30» северной широты и 49°34’00» и 50°00’12» восточной долготы. Его территория состоит из двух участков: основного, находящегося на полуострове Самарская Лука, и островного, расположенного на острове Середыш и прилегающих мелководьях Саратовского водохранилища.
Полуостров Самарская Лука образован излучиной реки Волги в среднем ее течении от с. Новодевичьего (Усинский залив Жигулевского моря) до Сызрани (Саратовское водохранилище – нижний бьеф Жигулевского гидроузла). С севера, востока и юга он омывается водами р. Волги, а с юга – водами р. Усы, только узкая полоса суши соединяет ее с восточной частью Приволжской возвышенности. Вдоль «Верхней», или «Северной», Волги край Самарской Луки на протяжении 70 км имеет сильно расчлененный рельеф и носит название Жигулевских гор или просто Жигулей.
Основной участок заповедника вытянулся вдоль берега Волги на 30 км, а в глубь материка его граница доходит до 13 км. В западной части на протяжении 6 км заповедные земли непосредственно выходят на берег Саратовского водохранилища. Восточнее территория заповедника отделена от Волги землями поселков и промышленных предприятий, занимающих надпойменную террасу и устьевые части горных долин (оврагов). В среднем ширина этой полосы составляет около 200 м. Общая длина границы основного участка заповедника достигает 120 км, из которых на протяжении 40 км территория заповедника непосредственно граничит с землями поселений городского округа Жигулевск. С юга, востока и запада к заповеднику примыкают леса и сельскохозяйственные земли, вошедшие в состав национального парка «Самарская Лука». Общая площадь заповедника составляет 23157 га, из них на территорию основного участка приходится 22587 га и островного – 570 га. Общая длина островов более 5 км, а ширина с прилегающими отмелями достигает 1200 м.
Благодаря своему географическому положению, разнообразию микроклиматических условий, обусловленному резко пересеченным «горным» рельефом, и особенностям геологического прошлого Самарская Лука занимает особое место в формировании природных комплексов всего Поволжья, рассматривается как рефугиум животных и растений доледникового периода. Здесь встречаются представители флоры и фауны степной, лесной и даже тундровой зон, распространены эндемичные и реликтовые виды, сохранившиеся с прошлых геологических эпох.